Neutralisationsteste

Für Neutralisationsteste werden Zellkulturen und Viren benötigt, deshalb werden diese serologische Methoden in der Abteilung Virologie durchgeführt.

Anwendungsbereich

	Mittels Neutralisationstest (NT) werden protektive (neutralisierende) Antikörper gegen Infektionserreger bestimmt. Für die Prüfung der vorhandenen Immunität ist nicht immer eine einfache Methode wie z. B. ein Enzym-Immuno-Assay (EIA) geeignet, da der Schutz bei manchen Infektionen nur mit den neutralisierenden Antikörpern korreliert. Das betrifft insbesondere die Immunität gegen Poliovirus und Diphtherie. Auch für die Beurteilung des Immunstatus bei anderen Infektionen, so wie Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV), Mumps, Masern, Vaccinia und Röteln können Neutralisationsteste herangezogen werden.
	Neutralisationsteste werden auch für die Virustypisierung (z.B. Enteroviren) verwendet.
	CMV-Neutralisationstest kann auch zur Abgrenzung einer primären von einer rekurrenten Infektion eingesetzt werden. (Eggers M, Metzger C, Enders G. Differentiation between acute primary and recurrent human cytomegalovirus infection in pregnancy, using a microneutralization assay. J Med Virol. 1998 Dec;56(4):351-8)

Testprinzip

Im Neutralisationstest wird von den zu testenden Seren eine Verdünnungsreihe hergestellt (1:2 - 1:512 oder 1:10-1:1280). Danach wird 1:1 eine definierte Menge Virus als Suspension zugegeben und bei 37°C 60-90 min inkubiert. Während der Inkubationszeit reagieren die Antikörper der Probe mit dem Virus. Als Indikatorsystem für diese Reaktion werden Mikroplatten mit geeigneten Zellen verwendet. Das Virus/Probe Gemisch wird auf die Platten mit den Zellen übertragen und 1-5 Tage bei 37°C mit 5 % CO2 inkubiert. Es wird diejenige Probenverdünnung ermittelt, die zu einer 50%igen Hemmung der Infektion im Vergleich zu einer nicht mit Antikörpern behandelten Viruskontrolle führt.

Infizierte  Zellen werden mit unterschiedlichen Methoden, je nach Virustyp sichtbar gemacht.

	Der durch Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus induzierte Cythopatische Effekt (CPE) kann unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden. Für jede Serum-Verdünnung werden 4 Platten-Vertiefungen verwendet. Nach 5 Tagen Inkubation werden die Vertiefungen auf der Mikroplatte gezählt, die einen CPE aufweisen und der Neutralisationstiter wird nach der Formel von Spearman und Kärber ermittelt.
	Polioviren verursachen nach 5 Tagen einen massiven CPE. Nach der Färbung mit Kristallviolettlösung erscheinen Mikroplatte-Vertiefungen mit intakten Zellen blau und mit infizierten weiß (Abbildung 1).
	Mumps- und Vaccinia- Viren werden durch einen klassischen Plaque-Test identifiziert. Nach der Zugabe von Virus werden die Zellen mit einem halbfesten Medium (Carboxymethylcellulose) überschichtet um eine Diffusion des Virus zu vermeiden. Nach 5 Tagen entstehen  durch virusinduzierten Zelllysis Plaques. Sie werden nach der Färbung mit Kristallviolett sichtbar. Ein Plaque entspricht einem infektiösen Viruspartikel   (Abbildung 2).
	Schon nach einem Inkubationstag können mit CMV, Masern- oder Rötelnvirus infizierte Zellen erkannt werden. Fixierte Zellen werden mit einem virusspezifischen monoklonalen Antikörpers (MAK) und einem Enzym-Konjugat (Sekundärantikörper) inkubiert. Das im anschließenden Schritt zugefügte Substrat reagiert mit dem Enzym und es kommt zu einer sichtbaren Farbumwandlung (Rotfärbung). Virusinfizierte Zellen lassen sich mikroskopisch anhand spezifischer Färbung der Zellen erkennen. Eine gefärbte Zelle entspricht einem infektiösen Viruspartikel (Abbildung 3).

Testdauer